使用磁性分离法的免疫沉淀实验步骤（用于蛋白质免疫印迹分析）
A. 溶液与试剂
注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。
- 20 X Phosphate Buffered Saline (PBS) #9808：要制备 1 L 1X PBS：添加 50 mL 20X PBS 至 950 mL dH2O 中，混合。
- 10X Cell Lysis Buffer #9803: 要制备 10 mL 1X 细胞裂解缓冲液，添加 1 mL 10X 细胞裂解缓冲液至 9 mL dH2O 中，混合。
注：使用前，立即加入 1 mM PMSF #8553。
- Protein A 或 G 磁珠：使用 Protein A #70024 进行小鼠 IgG 沉淀。
- 3X SDS 样品缓冲液：使用 Blue Loading Buffer Pack #7723。通过添加 1/10 体积的 30X DTT 到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液中，制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液。
- Magnetic Separation Rack：使用 #14654。
B. 制备细胞裂解物
- 吸干培养基。添加含有调节分子的新鲜培养基，对细胞进行所需时间的处理。
- 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
- 去除 PBS 并给每个平板 (10 cm) 添加 0.5 mL 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，并将平板放在冰上孵育 5 分钟。
- 从板上刮下细胞，并且将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
- 在冰上对样品进行 3 次超声处理，每次 5 秒。
- 使用微量离心机在 4°C 下以 14,000 x g 的离心力离心 10 分钟，然后将上清液转移到一个新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。
C. 免疫沉淀法
细胞裂解物预澄清（强烈建议）
强烈建议进行细胞裂解物预澄清步骤，以减少与 Protein A 或 G 磁珠的非特异性蛋白结合。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。
- 稍微涡旋母液试管，以重悬磁珠。
重要事项：磁珠在使用前需进行预洗涤。
- 转移 20 µL 磁珠混悬液到一个干净的试管中。将试管放在磁力分离架上 10-15 秒。
一旦溶液变澄清，便小心清除缓冲液。添加 500 µL 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中，短暂涡旋以洗涤磁珠。将试管放回磁力分离架上。待溶液变澄清后，移除缓冲液。再次进行洗涤步骤。
- 添加 200 µL 细胞裂解物到 20 µL 预洗涤的磁珠中。
重要事项：最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度范围为 250 µg/mL 至 1.0 mg/mL。
- 室温下旋转孵育 20 分钟。
- 使用磁力分离架将磁珠与裂解物分离。将预澄清的裂解液转移至一个干净的试管中。丢弃磁珠沉淀物。
免疫沉淀法
重要事项：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行实验。
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一抗 |
推荐的 IgG 对照 |
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兔多克隆抗体 |
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Rabbit monoclonal antibody |
Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 |
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小鼠单克隆 IgG1 抗体 |
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小鼠单克隆 IgG2a 抗体 |
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小鼠单克隆 IgG2b 抗体 |
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小鼠单克隆 IgG3 抗体 |
- 将一抗（按产品网页或产品说明书中推荐的合适稀释比例制备）加入到 200 µL 细胞裂解液中。在 4°C 下旋转孵育过夜，从而形成免疫复合物。
- 预先洗涤磁珠（参见细胞裂解物预澄清部分，步骤 1 和 2）。
- 将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到一根含有已洗涤磁珠沉淀物的试管中。
- 室温下旋转孵育 20 分钟。
- 将试管放在 Magnetic Separation Rack #14654 上，使磁珠沉淀。等待 1-2 分钟，直至溶液澄清。用 500 µL 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
- 用 20-40 µL 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。短暂涡旋搅拌以混合，然后再用微量离心机离心 30 秒。
- 将样品加热到 95–100°C，并持续 5 分钟。
- 将试管放在 Magnetic Separation Rack #14654 上，使磁珠沉淀。等待 1-2 分钟，直至溶液澄清。将上清液转移到新试管。上清液为样品。
- 将样品 (15-35 µL) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。
- 采用蛋白质免疫印迹法分析样品。请参阅蛋白免疫印迹法实验步骤。
注：为尽量减少变性重链对目标条带的掩蔽或由变性轻链产生的干扰，建议采用以下二抗：
对于分子量约为 50 kDa 的蛋白质：
Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb #45262
Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate) #93702
Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678
Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127
对于分子量约为 25 kDa 的蛋白质：
Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678
Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127