用 SignalStain® Boost Detection Reagent 进行免疫组织化学实验步骤 - 石蜡切片

重要事项：请参阅产品说明书首页或 产品网页上的“应用”部分， 以确定某产品是否已经验证适用于石蜡包埋 (IHC-P) 组织切片。

注：有关适当的抗体稀释倍数、稀释剂和抗原修复溶液， 请参阅相关产品的实验步骤。

A. 溶液与试剂

注：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 二甲苯。
2. 组织级无水变性乙醇（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH2O)。
4. 洗涤缓冲液：
   1. 1X 含 Tween 20 的 Tris 盐缓冲液 (TBST)：要制备 1 L 1X TBST，将 100 mL 10X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST) (#9997) 加入 900 mL dH2O 中，混合。
5. 抗体稀释剂的选择：
   1. SignalStain^® Antibody Diluent：(#8112)
   2. TBST/5% Normal Goat Serum：在 5 mL 1X TBST 中，加入 250 µL Normal Goat Serum (#5425)。
   3. PBST/5% Normal Goat Serum：在 5 mL 1X PBST 中，加入 250 µL Normal Goat Serum (#5425)。
      • 1X PBST：要制备 1 L 1X PBST，将 50 mL 20X Phosphate Buffered Saline with Tween 20 (PBST) (#9809) 加入 950 mL dH2O 中，混合。
   4. 1X Phosphate Buffered Saline with Tween^® 20 抗体 稀释剂：要制备 5 mL 1X PBST，取 250 µL Phosphate Buffered Saline with Tween 20 (PBST-20X) (#9809)， 用 5 mL dH2O 稀释。
6. 抗原修复剂的选择：
   1. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 1X 柠檬酸盐修复液， 取 25 mL SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746)，用 225 mL dH2O 稀释。
   2. 1X EDTA 修复液：要制备250 mL 1X EDTA 修复液， 取 25 mL SignalStain^® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747)， 用 225 mL dH2O 稀释。
   3. TE：10 mM Tris/1 mM EDTA，pH 9.0：要制备 1 L，将 1.21 g Tris 碱 (C4H11NO3) 和 0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 加入 950 mL dH2O 中。调整 pH 值至 9.0，然后用 dH2O 将最终溶液定容至 1 L。
   4. 胃蛋白酶：在 Tris-HCl 中为 1 mg/mL，pH 2.0。
7. 3% 过氧化氢水溶液：要制备 100 ml 的溶液：加入 10 mL 30% H2O2 至 90 mL dH2O 中。
8. 封闭液：1X TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. 1X TBST/5% Normal Goat Serum：加 250 µL Normal Goat Serum (#5425) 至 5 mL 1X TBST 中。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：向 4 mL 的 dH2O 中添加 1 mL 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
9. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125；HRP, Rabbit #8114；HRP, Rat #72838；HRP, Goat #63707；AP, Mouse #31926；AP, Rabbit #18653；AP, Rat #15764；AP, Goat #26927)。
10. 底物：HRP 兼容：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)；SignalStain^® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit (#96632)； SignalStain^® Deep Black Peroxidase Substrate Kit (#72986)；SignalStain^® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit (#69644)；AP 兼容：SignalStain^® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit (#76713)； SignalStain^® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit (#12824)
11. Hematoxylin：Hematoxylin (#14166)
12. 封片剂：SignalStain^® Mounting Medium II (#84583)；SignalStain^® Aqueous Mounting Medium (#27290)

B. 脱蜡/复水

注：务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育 2 次，每次 10 分钟。
2. 将切片放入 dH2O 中洗涤两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

注：请参阅产品特定的实验步骤， 以获取有关修复液/实验步骤的具体建议。

1. 对于柠檬酸：将切片浸入1 X 柠檬酸盐修复液， 再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 (95°-98°) 10 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。
2. 对于 EDTA：将切片浸入 1X EDTA 修复液， 再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 (95°-98°) 15 分钟。无需冷却。
3. 对于 TE：将切片浸入 pH 值为 9.0 的 10 mM Tris/1 mM EDTA 溶液中，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 (95°-98°) 18 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。
4. 对于胃蛋白酶：在 37°C 下消化 10 分钟。

D. 染色

注：有关推荐的抗体稀释剂，请参阅产品特定的 实验步骤。

1. 在 dH2O 中洗涤切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 洗涤切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片 5 分钟。
5. 在每个切片上滴加 100-400 µL 首选封闭液， 在室温下孵育 1 小时。
6. 清除封闭液，每个切片中加入用推荐的抗体稀释剂稀释好的 100-400 µL 一抗。
7. 在 4°C 下过夜孵育。
8. 将 SignalStain^® Boost Detection Reagent 平衡至室温 。
9. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次， 每次 5 分钟。
10. 根据需要，滴入 1-3 滴 SignalStain^® Boost Detection Reagent 覆盖切片。放入加湿箱中，在室温下孵育 30 分钟 。
11. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
12. 按照产品使用信息中的建议准备基材。
13. 将 100-400 µL 底物涂在载玻片上。监控反应。 推荐的反应时间因使用的底物而异。 请参阅产品使用信息，以了解具体指南。
14. 将切片浸入 dH2O 中。
15. 如果需要，按照说明书使用 Hematoxylin (#14166) 对切片进行复染。
16. 用 dH2O 洗涤切片两次，每次 5 分钟。
17. 脱水环节：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中，将切片重复孵育 2 次，每次 10 秒 。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒
18. 使用盖玻片和兼容的封片剂封片。