SignalStain® Boost Detection Reagent 免疫组织化学实验步骤 - 冰冻切片

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 二甲苯。
2. 乙醇（无水变性，组织级 100% 和 95%）。
3. Hematoxylin (#14166)。
4. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 配制 1 L 1X PBS： 添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中，混合。
5. 固定液选择：
   1. 10% 中性缓冲福尔马林。
   2. 丙酮。
   3. 甲醇。
   4. 3% 甲醛：要制备 100 ml 溶液， 则将 18.75 ml 的 16% 甲醛加入到 81.25 ml 的 1X PBS 中。
6. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS) 洗涤缓冲液：(#12498) 制备 1 L 1X TBS：添加 100 ml 10X TBS 至 900 ml dH₂O 中，混匀。
7. 甲醇/过氧化物酶：制备方法：将 10 ml 30% H₂O₂ 加入到 90 ml 甲醇中。 储存于 -20°C 的温度下。
8. 封闭液：1X TBST/5% Normal Goat Serum 或者 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. 1X TBST/5% Normal Goat Serum：添加 250 µL Normal Goat Serum (#5425) 至 5 mL 1X TBST 中。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：向 4 mL 的 dH₂O 中添加 1 mL 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
9. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125；HRP, Rabbit #8114；HRP, Rat #72838；HRP, Goat #63707；AP, Mouse #31926；AP, Rabbit #18653；AP, Rat #15764；AP, Goat #26927)。
10. 底物：HRP 兼容：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)； SignalStain^® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit (#96632)；SignalStain^® Deep Black Peroxidase Substrate Kit (#72986)；SignalStain^® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit (#69644)；AP 兼容：SignalStain^® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit (#76713)；SignalStain^® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit (#12824)。
11. 封片剂：SignalStain^® Mounting Medium II (#84583)； SignalStain^® Aqueous Mounting Medium (#27290)。

B. 切片制作

1. 对于储存在 -80°C 下的组织：切片前， 将其从冰箱中取出，在 -20°C 的温度下平衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
2. 将组织切成厚度在 6-8 µm 之间的切片，置于带正电荷的载玻片上。
3. 固定前，将切片放置在工作台上风干几分钟（这样可以增加切片的粘附作用）。

C. 固定剂的选择

注：确定所用抗体的最佳固定剂。

组织切片晾干后，按照以下步骤使用最佳的固定剂固定。

1. 10% 中性缓冲福尔马林：在室温下固定 10 分钟。立即进入染色步骤 （D 部分）。
2. 冷丙酮：在 -20°C 下固定 10 分钟。风干。立即进行染色（D 部分）。
3. 甲醇：在 -20°C 下固定 10 分钟。立即进入染色步骤（D 部分）。
4. 3% 甲醛：在室温下固定 15 分钟。立即进行染色（D 部分）。
5. 3% 甲醛/甲醇：室温下于 3% 甲醛中固定 15 分钟，随后于 -20°C 甲醇中固定 5 分钟（中间无需润洗）。立即进行染色（D 部分）。

D. 染色

1. 用洗涤缓冲液清洗切片两次，持续 5 分钟。
2. 在甲醇/过氧化物酶中室温孵育 10 分钟。
3. 用洗涤缓冲液清洗切片两次，持续 5 分钟。
4. 在每个切片上滴加 100-400 µl 封闭液，在室温下孵育 1 小时。
5. 去除封闭液，每个切片中加入用推荐的抗体稀释液稀释好的 100-400 µL 一抗。
6. 在 4°C 下过夜孵育。
7. 将 SignalStain^® Boost Detection Reagent 平衡至室温。
8. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 根据需要，滴入 1-3 滴 SignalStain^® Boost Detection Reagent 覆盖切片。
10. 在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
11. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
12. 按照产品说明书中的建议准备底物。
13. 将 100-400 µL 底物涂在载玻片上。观察反应。推荐的反应时间因 使用的底物而异。请参阅产品使用信息，以了解具体指南。
14. 将切片浸入 dH₂O 中。
15. 如有需要，可根据制造商的说明使用苏木精对切片进行复染。
16. 用 dH₂O 洗涤切片两次，每次 5 分钟。
17. 切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
18. 用盖玻片盖住切片。