HRP 化学发光 ELISA-P

A. 溶液与试剂

1. 碳酸盐缓冲液：15 mM Na₂CO₃、35 mM NaHCO₃、0.2 g/L NaN₃ (pH 9.6)。将 1 µM 合成肽加入碳酸盐缓冲液中。
2. 10X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要配制 1 L，添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4 g 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄) 和 2.4 g 磷酸二氢钾 (KH₂HPO₄) 到 1 L dH₂O 中。将 pH 值调节至 7.4。
3. 洗涤缓冲液：含有 0.05% Tween-20 的 1X PBS (PBST) (9809)
4. 封闭液：用 PBST 稀释的 10 mg/mL 牛血清白蛋白 (BSA) (9998)
5. 一抗稀释缓冲液：用 PBST 稀释的 1 mg/mL BSA
6. 二抗稀释缓冲液：用 PBST 稀释的 3% BSA
7. 96-孔板：化学发光检测建议使用纯白或不透明的平板。

B. 让肽结合 96 孔板

1. 对于 96 孔微滴定平板的各孔，用通过碳酸盐缓冲液配制的 100 µL 1 µM 合成肽包被，在 4°C 下孵育过夜，或在 37°C 下孵育 2 至 6 小时。如果肽不结合或不吸附，可尝试 pH 值在 4-8 内的其他缓冲液。
2. 平板按 200 µL/孔用洗涤缓冲液清洗三次。
3. 在 37°C 下，平板按 200 µL/孔用封闭液封闭 1 小时。用洗涤缓冲液洗涤平板 3 次。（如果需要，可以持续 1-2 个月将干燥平板保持在 4°C 下。）

C. HRP 偶联一抗的实验步骤

1. 使用一抗稀释缓冲液配制建议稀释度的 HRP 偶联一抗。向各孔添加 100 µL，并在 37°C 下孵育 1 小时。
2. 用洗涤缓冲液洗涤 5 次。
3. 通过混合等量的 Luminol/Enhancer Solution (#7003) 和 Stable Peroxide Buffer 来配制工作液。
4. 添加底物后 1-10 分钟内，使用平板光度计测量在 425 nM 处的相对光单位 (RLU)。
5. 在 10 分钟内读取以获得最佳信号强度。

D. HRP 偶联二抗的实验步骤

1. 用一抗稀释缓冲液配制推荐稀释比例的一抗。 向孔中加入 100 µL，并在 4°C 下孵育过夜，或在 37°C 下孵育 2 至 6 小时。
2. 用洗涤缓冲液洗涤 3 次。
3. 用二抗稀释缓冲液配制推荐稀释比例的 HRP-conjugated Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076。 向孔中加入 100 µL，并在 37°C 下孵育 1 小时。
4. 用洗涤缓冲液洗涤 5 次。
5. 通过混合等量的 Luminol/Enhancer Solution (# 7003) 和 Stable Peroxide Buffer 来配制工作液。
6. 添加底物后 1-10 分钟内，使用平板光度计测量在 425nM 处的相对光单位 (RLU)。
7. 在 10 分钟内读取以获得最佳信号强度。