流式细胞术，Triton X-100 透化实验步骤

重要事项：请参阅产品网页上的产品特定的 流式细胞术实验步骤，以了解相应的固定和透化条件 以及建议的抗体稀释比例。

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可高效地通过我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton^™ X-100) #51995 整套购买，或使用下文所列的 货号单独购买。

注：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：要制备 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS (#12528) 至 900 ml 水， 混合。
2. 4% Formaldehyde, Methanol-Free (#47746)
3. 细胞透化缓冲液：购买即用型 (#39487) 或者通过添加 30 µl Triton^™ X-100 至 10 ml 抗体稀释缓冲液来制备 10 ml。保存在 4°C 下。
4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型 Flow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616)， 或在 100 ml 1X PBS 中溶解 0.5 g Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) 来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。保存在 4°C 下。
5. 推荐的二抗：对于未偶联抗体的检测， 请选择与您的一抗（例如兔） 的宿主物种匹配的二抗。 点击此处以获取 可用于流式细胞术的二抗的最新列表。
6. （可选） FluoroClear Blocking Buffer (#33449)

注：在您的实验中加入荧光细胞染料 （包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料 产品页，了解建议的实验步骤。访问我们的网站， 了解经流式细胞术验证的细胞染料列表。

B. 固定与透化

注：固定前，应分离贴壁细胞或组织， 使它成为单细胞悬浮液。

注：最优的离心条件与细胞 类型和试剂用量相关。一般，1-5 分钟 150-300 xg 将 足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过 离心来洗涤。

注：如果表位被甲醛 和/或 Triton^™ X-100 破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标志物或其他胞外 蛋白的抗体。在固定和 透化过程期间，这类抗体将 保持与目的靶标结合。如果您不确定， 请进行小规模实验。

1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止细胞之间交联。
3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于 合适的废液容器中。
5. 每 100 万个细胞使用约 100 µl 细胞透化缓冲液 重悬细胞。
6. 在室温下孵育 10 分钟。
7. 继续进行染色或将细胞在 PBS 中于 4°C 下保存过夜。

C. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或其他方法计数细胞。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或孔板中。（通常，每次测定 5×10⁵ 至 1×10⁶ 个细胞。）
2. 将细胞离心，弃去上清液。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞， 这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样用抗体稀释缓冲液稀释 。
4. 室温 (20-25 °C) 下孵育 1 小时。
5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去 上清液。重复。如果使用抗体偶联物，则跳到 步骤 9。
6. 在 100 µl 稀释的荧光素偶联的二抗 （这种二抗按建议的稀释比例以抗体稀释缓冲液制备） 中重悬细胞。
7. 室温 (20-25 °C) 下孵育 30 分钟。避光 。
8. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去 上清液。重复。
9. 在 1X PBS 中重悬细胞，在流式细胞分析仪上分析。

如有任何问题，请联系我们。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。