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PathScan® Sandwich ELISA 实验步骤（比色 ELISA - 针对冻干抗体试剂盒）

A. 溶液与试剂

注：用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条：使用前，让所有测试条达到室温。
  2. 检测抗体：以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂（绿色溶液）以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分复溶。要制备最终使用溶液， 则在一个干净试管中添加 1.0 ml 复溶的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中， 轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody*：以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂（红色溶液）以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟， 同时不时轻轻混合，以充分复溶。要制备最终使用溶液， 则在一个干净试管中添加 1.0 ml 复溶的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中，轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂：绿色稀释剂，用于复溶和稀释检测抗体 。
  5. HRP 稀释剂：红色稀释剂，用于复溶和稀释 HRP-Linked Antibody。
  6. 样品稀释剂：蓝色稀释剂，用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X Wash Buffer：用纯净水稀释 20X Wash Buffer （包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中）来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液：10X Cell Lysis Buffer #9803：这种缓冲液可存放在 4°C 供短期使用（1–2 周）。建议：使用之前，立即添加 1 mM 苯甲酰磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB Substrate (#7004)。
  10. STOP Solution (#7002)。

*注：某些 PathScan® ELISA Kit 可能包含 HRP-Linked Streptavidin，以替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，对细胞进行所需时间的处理。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS 并向每个平板（直径 10 cm） 添加 0.5 ml 含 1 mM PMSF 的冰冷 1X Cell Lysis Buffer，并将平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 用微量离心机离心 10 分钟 (x14,000 rpm)，并将上清液转移至一支新试管。上清液即为细胞裂解物。 按单次样品量分装保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1200 rpm）去除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，对细胞进行一段时间的处理。
  2. 通过低速离心分离（约 1200 rpm）采集细胞，并用 5–10 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1X Cell Lysis Buffer 中裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 用微量离心机离心 10 分钟 (x14,000 rpm)，并将上清液转移至一支新试管。上清液即为细胞裂解物。 按单次样品量分装保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后，掰下所需的微孔量。 将微孔放置在板条架中。未使用的微孔必须重新密封，并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂（包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中，蓝色）稀释。每个试剂盒的单独说明书都提供一条敏感度曲线，可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度 曲线显示了一个范围内裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地 按压在微孔顶部。在 37°C 下孵育平板 2 小时。或者， 也可以在 4°C 下孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔：
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X Wash Buffer 洗涤 4 次，每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时，将平板重重拍在未用过的毛巾上，以便去除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 复溶的检测抗体（绿色）（参阅 A 部分，步骤 2）。 用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序（ C 部分，步骤 4）。
  7. 向每个孔添加 100 µl 复溶的 HRP 偶联二抗（红色）（参阅 A 部分， 步骤 3）。用胶带密封，将平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序（ C 部分，步骤 4）。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB Substrate。用胶带密封，将平板在 37°C 下孵育 10 分钟，或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP Solution。温和振摇数秒。

注：阳性反应的初始颜色为蓝色，加入 STOP Solution 后会变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目视测定：在添加 STOP Solution 后 30 分钟内读取。
    2. 用分光光度计测定：用无绒织物擦拭孔的底面。加入 STOP Solution 后 30 分钟内，读取 450 nm 处的吸光度。

2013 年 11 月发布