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  4. 直接偶联物免疫组织化学实验步骤（石蜡切片）

直接偶联物免疫组织化学实验步骤（石蜡切片）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 组织级无水变性乙醇（100% 和 95%）。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 洗涤缓冲液：
    1. 1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：配制 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST) (#9997) 加入到 900 ml dH2O 中，混合。
    2. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)：配制 1 L 1X PBS：将 100 mL 10X Wash Buffer, Phosphate Buffered Saline (#12528) 加入到 900 ml dH2O 中，混合。
  5. SignalStain® Antibody Diluent：(#8112)
  6. 1X EDTA Unmasking Solution：配制 250 mL 1X EDTA Unmasking Solution：将 25 mL SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747) 用 225 mL dH2O 稀释。
  7. 3% 过氧化氢水溶液：配制时，将 10 ml 30% H2O2 加入到 90 mL dH2O 中。
  8. 封闭液：1X TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum：在 5 ml 的 1X TBST 中加入 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution：在 4 mL 的 dH2O 中加入 1 mL Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  9. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)、 Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。
  10. （可选） TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher (#92401)。

B. 脱蜡/复水

注：在整个操作过程中，切勿让玻片变干。

  1. 脱蜡/水化合步骤：
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育 2 次，每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育 2 次，每次 10 分钟。
  2. 将切片放入 dH2O 中洗涤两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

  1. 将载玻片浸入 1X EDTA Unmasking Solution 中，置于微波炉内加热至沸腾，随后 在亚沸温度 (95°-98°) 下保持 15 分钟。无需 冷却。

    2. D. 染色

    1. 将切片放入 dH2O 中洗涤三次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 1X TBST 中孵育 5 分钟。
    3. 每张切片用 100-400 µl 优选封闭液在室温下封闭 1 小时。
    4. 去除封闭液，向每张切片加入 100-400 µl 用 SignalStain® Antibody Diluent 稀释的一抗。
    5. 在 4°C 下过夜孵育。
    6. 用 1X PBS 避光漂洗三次，每次 5 分钟。
      注：请参见下文 可选 TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 实验步骤。
    7. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI 封片。
    8. 要达到最佳效果，让封片液在室温下过夜固化。长期保存时， 将载玻片平放于 4°C 避光保存。

    TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 实验步骤

    接 D 部分第 6 步：

    重要事项：TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 与去垢剂 不兼容。任何 涉及去垢剂的步骤都必须在使用 TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 之前完成。

    1. 配制 TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 溶液：用 70% 乙醇按 1:20 稀释。涡旋混合。
      注：淬灭液需现配现用，若出现沉淀应 丢弃。建议在稀释前将溶于 DMF 的 TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher (20X) 储备液加热至 70°C，以避免产生 沉淀。
    2. 立即用 100 µL - 200 µL 淬灭液覆盖组织切片，在室温下处理 30 秒。
      重要事项：切勿让切片变干。切片可耐受较长时间的孵育（最长 3 分钟），前提是保持水合状态。
    3. 将载玻片轻磕吸水纸，除去多余的 TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher ，再转入 1X PBS。
    4. 用 1X PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。
    5. 继续进行复染/封片。