Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse) 实验步骤

! 表示实验步骤中需要根据进行的 CUT&Tag 反应次数来调整体积 的重要步骤。

注：在开始本实验步骤之前，请按照我们的 CUT&Tag Assay Kit #77552 实验步骤中的第一部分和第二部分，激活 Concanavalin A 珠子并制备细胞或组织样品。 然后继续第一部分。

一.添加 Drosophila Spike-In Nuclei Control 用于样品归一化

开始之前：

• 在室温下解冻 Drosophila Spike-In Nuclei Control。
• 尽量减少 Drosophila Spike-In Nuclei Control 的冷冻和解冻次数。分装成小体积，以将冻融循环限制在 4 次或更少。 超出此限度可能会降低 果蝇 基因组的比对率，并且需要增加每次反应的 spike-in 细胞核用量；例如，经过 9 次冻融循环后， 果蝇比对率可能降低约 50%。
• 与使用兔一抗的反应相比，对于使用 小鼠 一抗的 CUT&Tag 反应，建议减少 Drosophila Spike-In Nuclei Control 的用量。此调整有助于维持 宿主与 spike-in 物种之间标签化染色质的一致比例， 以补偿小鼠抗体在 CUT&Tag 测定中通常较低的活性，并防止来自 果蝇核的读数过多。

1. 按照 CUT&Tag Assay Kit #77552 实验步骤中的第二部分或附录所述制备细胞悬液后，取 100 µL 分装至独立的 1.5 mL 试管中，用于每个反应。
2. 向每个含有 100,000 至 250,000 个细胞或 1-2.5 mg 组织的反应中加入 2 µL Drosophila Spike-In Nuclei Control。对于高丰度靶标，此 spike-in 核与细胞的比率通常可使果蝇 spike-in 归一化 读数占总测序读数的约 0.5%-10%。

   注：Drosophila Spike-In Nuclei Control 的最佳用量因 CUT&Tag 而异， 应由用户自行优化，使 spike-in 归一化读数占总 测序读数的约 0.5%-10%。如果使用的细胞量低于 100,000 个或组织量低于 1 mg，则按比例减少 Drosophila Spike-In Nuclei Control 的用量，维持每 100,000 个细胞或每 1 mg 组织 对应 2 µL 的比例（例如，对于 50,000 个细胞，使用 1 µL Drosophila Spike-In Nuclei，对于 25,000 个细胞，使用 0.5 µL Drosophila Spike-In Nuclei）。此外，如果靶标丰度较低（例如某些转录因子或辅因子）， 则 spike-in 核的用量可能需要根据经验进一步减少。

3. 轻轻地上下吸打混合。
4. 立即进入第二部分。

二、Concanavalin A 珠子和一抗的结合

注：对于本部分中的所有孵育步骤，无需通过摇动或旋转来混合样品。 相反，我们建议只需将试管放在架子上，置于指定温度下即可。在孵育步骤中对样品进行混合操作并不会提升检测性能。 相反，旋转或 摇晃样品可能会导致珠子聚集增加，并因可能粘附在管 壁和管盖上而造成珠子损失。

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 将 Digitonin Solution #16359 在 90-100°C 下加热 5 分钟，并确保其完全解冻并呈溶液状态。 使用期间，立即将解冻的 Digitonin Solution #16359 置于冰上。当天用毕后，置于 -20°C 下储存。
• 使用前彻底解冻 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 和 100X Spermidine #27287，并且在当天用毕后置于 -20°C 下储存。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 置于冰上时会重新冻结。
• 每次反应制备 100 µL 完整的抗体结合缓冲液并置于冰上。

1. 将在 CUT&Tag Assay Kit #77552 实验步骤第一部分步骤 7 中制备的活化的 Concanavalin A 珠子平衡至室温，并通过轻轻地上下吸打来彻底混合。
2. 将 10 µL 珠子悬液添加到第一部分 步骤 3 中制备的每管细胞 + Drosophila Spike-In Nuclei 中。
3. 通过上下吸打将样品充分混合。将样品在室温下孵育 5 分钟。
4. 将试管在磁力架上放置 30 秒至 2 分钟，然后去除并丢弃上清液。
5. 从磁力架上取下试管。每次反应添加 100 µL 完整的抗体结合缓冲液，轻轻地上下吸打混合，并置于冰上。
6. 向每个反应管中加入适量的检测抗体和 1 µL H2Av Mouse Monoclonal Antibody，轻轻地上下吸打混合。

   注：CUT&Tag 需要的抗体量会有所不同，应由使用者确定。 对于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751，或阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 或 Normal Mouse IgG #68860，加入 2 µL 抗体到反应中。 如果可能，我们强烈建议在检测中使用经 CUT&Tag 验证的抗体。 CST 提供一系列经 CUT&Tag 验证的 抗体，并附有支持性数据和适当的 稀释比例。

7. 在室温下孵育 1 小时。该步骤可以延伸至在 4°C 下过夜。
8. 按照 CUT&Tag Assay Kit #77552 中的第四至第七部分继续进行 CUT&Tag 实验。

三、用于样本归一化的下一代测序分析 (NGS)

对于样品归一化，将所有样品的 CUT&Tag 测序数据同时比对至检测基因组（例如人、 小鼠或其他物种）和黑腹果蝇基因组。计算每个样品中唯一的 spike-in 读数与 总 唯一比对读数的比率。选择比率最低的样品（如下表中的样品 4）作为参考样品，并使用提供的公式计算其他样品的归一化系数。 在生物信息学分析过程中，通过缩放 bigWig 文件（例如使用 deepTools bamCoverage）或对每个样品比对至检测基因组的唯一读数进行降采样处理，来应用这些系数。 如果各样品间的测序深度一致，也可以使用 spike-in 读数绝对值而非其与总读数的比率来计算归一化系数。

在药物处理实验中使用小鼠 H3K27me3 抗体的 NGS 检测样品归一化示例（见图 1）

NGS 归一化系数 = 参考样品的 spike-in 唯一读数 占唯一比对总读数的比率 / 其他样品的 spike-in 唯一读数占唯一比对总读数的 比率。

附录：疑难排解指南

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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